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    公开号:WO1992011384A1
    申请号:PCT/JP1991/001736
    申请日:1991-12-19
    公开日:1992-07-09
    发明作者:Gilbu Soe；Isao Kohno；Mami Shiiba
    申请人:Iatron Laboratories, Inc.；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 抗ヒトプラスミン一 2—プラスミンィンヒビター複合 体抗体、 ハイプリドーマ及び免疫学的測定方法 技術分野
    [0002] 本発明はヒトプラスミン一 α 2—プラスミンィンヒビター複 合体（Plasmin- a 2 -Plasmin Inhibitor Complex：以下 P I Cの略 称を用いることがある） に対して反応性を有する各種のモノク ローナル抗体群、 それらのモノクローナル抗体を分泌する各種 のハイプリドーマ群及びそれらのモノクローナル抗体群を用い たヒトプラスミン一 α 2—プラスミンインヒビター複合体の免 疫学的定量方法に関する。 背景技術
    [0003] 汎発性血管内凝固症候群（ D I C ： Disseminated intravascular coagulation )患者の血漿中や、 ゥロキナーゼ又はティッシュプ ラスミノーゲンァクチベータ （ t一 P A ) を用いた血栓溶解療 法実施中の患者血漿中では、 プラスミノーゲンが活性化されて プラスミンが生成される。 生成されたプラスミンは、 流血中で は瞬時にな 2プラスミンインヒビター （ な 2 P I ：青木ら、
    [0004] J.Biol.Chem.,251,5956-5965,1976 ) と 1 ： 1の複合体、 即ち前記 の P I Cを形成する。 従って、 P I Cを測定することにより、 プラスミンの生成、 即ち、 線溶系活性化の事象を把握すること ができる。 最近、 血漿中の P I Cは D I Cの診断及び血栓溶解 療法のモニター等の分子マーカーとして重要視されている。 そ のため、 血液あるいは血漿中の P I cの量を正確かつ簡単に測 定する必要がある。
    [0005] 従来から知られている P I Cの測定法としては、 以下の 5つ の方法を挙げることができる。 第 1の方法は、 二次元交叉免疫 電気泳動法を用いる方法である。 第 2の方法は、 P I Cのネオ アンチゲンを認識するボリクローナル抗体を用いたラテックス 凝集法である。 第 3の方法は、 プラスミノーゲンに対するボリ クローナル抗体と α 2—プラスミンィンヒビターに対するボリ クローナル抗体の両者を用い、 その一方を固定化抗体とし、 他 方を酵素標識抗体とした、 酵素免疫測定法である， 第 4の方法 は、 α 2—プラスミンィンヒビターに存在するプラスミンの繊 維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識するモノクローナ ル抗体とプラスミンポリクローナル抗体の両者を用い、 その一 方を固定化抗体とし、 他方を酵素標識抗体とし、 血漿検体を 1 2 0 0倍に希釈して測定する酵素免疫測定法である。 第 5の 方法は、 P I Cのネオアンチゲンを認識するモノクローナル抗 体 2種又は 3種を用いるラテックス凝集法である。
    [0006] しかしながら、 第 1の方法には、 感度が低く定量性に欠ける という欠点があった。 第 2の方法には、 P I Cを特異的に測定 できないという欠点があった。 第 3の方法は、 感度は良好であ るが、 抗血清の安定な確保が困難であり、 免疫反応が 2工程で あるので操作が煩雑で、 測定に長時間を要するという欠点があ つた。 第 4の方法は、 α 2—プラスミンインヒビターに対する モノクローナル抗体を使用する点及び免疫反応を 1工程で操作 する点で前記の第 3の方法が改良されているが、 酵素免疫反応 が有する欠点、 即ち、 操作が煩雑で測定に長時間を要するとい う問題点を解消するものではなかった， 更に、 第 4の方法には、 1工程の免疫反応を導入するために、 検体を 1 2 0 0倍に希釈 する工程が必要になるという欠点もあった， 第 5の方法は、 ボ リクローナル抗体を用いた第 2の方法と比較して、 特異性や測 定感度において差異はなく、 P I Cを特異的に測定できないと いう問題点を解決するものではなかった，
    [0007] 本発明者は、 P I Cを簡便に、 正確にそして再現性よく測定 する方法を開発するべく鋭意研究をした結果、 P I C及びプラ スミノーゲンの両者に反応性を示す第 1のモノクローナル抗体 ( P I C— 1 ) 、 P I C及び α 2—プラスミンインヒビターの 両者に反応性を示す第 2のモノクローナル抗体（P I C— 2 ) 、 そして P I Cに特異的反応性を示すが、 P I Cの構成タンパク 質であるプラスミノーゲン及びな 2—プラスミンィンヒビター には反応性を示さない第 3のモノクローナル抗体（P I C— 3 ) の、 3種のモノクローナル抗体を見出し、 これらのモノクロ一 ナル抗体の 2種以上の組み合わせを用いると、 血漿中の P I C を、 血漿検体の希釈工程を必要とせず、 迅速かつ正確に、 しか も検体中に遊離の状態で存在するプラスミノーゲン及び 2 —プラスミンィンヒビターの妨害を受けずに、 特異的に測定す ることができることを見出した， 従って、 本発明の目的は、 前 記の新規モノクローナル抗体、 そのモノクローナル抗体を産生 するハイプリドーマ細胞、 及びそのモノクローナル抗体を用い る免疫学的定量方法を提供することにある。 発明の開示
    [0008] 従って、 本発明は、 ( 1 ) ヒトプラスミン一 " 2—プラスミンインヒビター複合体 及びヒトプラスミノーゲンと特異的に反応する第 1のモノクロ ーナル抗体、
    [0009] ( 2 ) ヒトプラスミン一 2—プラスミンインヒビター複合体 及びヒト 2—プラスミンィンヒビターと特異的に反応する 第 2のモノクローナル抗体、 及び
    [0010] ( 3 ) ヒトプラスミン一 な 2—プラスミンインヒビター複合体 と特異的に反応し、 ヒトプラスミノーゲン及びヒト α 2—プラ スミンィンヒビターとは反応しない第 3のモノクローナル抗体 に関する。
    [0011] 更に、 本発明は、 前記の第 1〜第 3の各モノクローナル抗体 を分泌するハイプリドーマ又はそれらに由来する細胞株にも鬨 する。
    [0012] 更に、 本発明は、 不溶性担体に固定化された、 前記の第 1 〜 第 3の各モノクローナル抗体少なくとも 2種と、 被検試料とを 接触させ、 被検試料における凝集反応を観察することを特徴と する、 ヒトプラスミン一 α 2—プラスミンィンヒビター複合体 の測定方法にも関する。 図面の簡単な説明
    [0013] 第 1図は、 本発明のモノクローナル抗体ラテックス複合体を 用いて、 健常人血漿（ 1 2検体）及び D I C患者血漿（ 1 5検 体） 中の P I C量を測定した結果を示す説明図である。 発明を実施するための最良の形態
    [0014] 以下、 本発明を、 モノクローナル抗体、 ハイプリドーマ及び 免疫学的測定方法の順に説明する。
    [0015] 免疫原として用いるヒト P I Cは、 例えば、 P 1 o wらの方 法 (丄 Lab.Clin.Med.93, 199-209,1979 ) に従って調製することが できる。 即ち、 ヒト （健常人） の血漿からプラスミノーゲンを 除去し、 プラスミノーゲン不含のこの血漿に、 プラスミンを徐 々に加えることにより P I Cを生成させ、 生成した P I Cを適 当な親和性ゲルに吸着させる。 この吸着 P I Cを適当な緩衝液 で溶出させ、 更に、 イオン交換クロマトグラフィーや分子ふる いクロマトグラフィー等による精製操作で処理し、 純化ヒト P I Cを得る。 こうして得られたヒト P I Cは、 S D S— P A G n ( S D S― Polyacrylamidegel electrophoresis ) で単一のノくンド を示す，
    [0016] 次に、 精製したヒト P I C免疫原溶液を用いて哺乳動物 （例 えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ又はゥマ） をイン · ビボ 免疫法により免疫する。
    [0017] 具体的には、 例えば、 精製したヒト P I C免疫原溶液を等量 のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュバントと乳 化するまで混合する。 この混合液を、 例えばマウスの皮下に投 与する （第 1回免疫） 。 以後、 2〜4週間の間隔で同様の操作 を行い、 数回免疫する。 最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に 取り出し、 ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を 調製し、 細胞融合工程に用いる。
    [0018] 細胞融合に用いるもう一方の親細胞であるミエローマ細胞 (骨髄腫細胞） としては、 各種の公知の細胞株、 例えば、 P 3 ( P 3 / X 6 3 - A g 8 ) 〔Nature,256，495-497(1975)〕 、 p 3 一 U 1 し UurrentTopics in Micro Diology and Immunology, 81;1-7(1978)3 、 NS— 1 〔 Eur丄 Immunol. ,6; 511-519(1976)〕 、 MPC-11 〔Cell,8;405-415(1976)〕 、 S P 2/0 Nature, 276;269-270(1978)〕 、 F O J.Immunol.MetL,35; 1-21(1980) 、 X 63. 6. 55. 3 J.Immunol.,123; 1548- 1550(1979) . S 194 CJ-Exp.Med,148;313-323(1978)] 、 又はラットにおける R210 〔Nature，277;131-133(1979)〕などを使用することがで さる。
    [0019] 免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合は通常の方法で 行うことができ、 例えば、 公知の融合促進剤（ボリエチレング リコール又はセンダイウィルスなど） を用い、 場合により補助 剤（ジメチルスルホキシドなど） を用いることもできる。 免疫 脾臓細胞とミエローマ細胞との使用比率も常法と同様でよく、 例えば、 ミエローマ細胞に対して脾臓細胞を約 1〜10倍程度 の量で用いる。 融合用培地としては、例えば、 40% (w/v) ボリエチレングリコールを含むダルべッコ改変ィ一グル培地
    [0020] (DMEM) を用いることができる β 融合は、 前記の培地内で 免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって 行う。 続いて、 選別用培地（例えば、 HAT培地） を用いてハ イブリドーマ以外の細胞を除去し、 ハイプリドーマ培養上清の 抗体産生の有無を、 例えば EL I SA法によって測定し、 目的 とするハイプリドーマを分離する。
    [0021] こうして得られた、 本発明のモノクローナル抗体 P I C— 1、 P I〇ー2又は I C— 3を分泌するハイプリドーマ P I C 一 1、 P I C— 2又は P I C— 3は、 通常の培地で継代培養す ることができ、 また液体窒素等の中で容易に長期間保存するこ とができる。 また、 前記のハイプリドーマを培養する培地としては、 ハイ プリドーマの培養に適した任意の培地を用いることができ、 好 適には D M E Mにゥシ胎児血清、 L一グルタミン、 Lーピルビ ン酸及び抗生物質 （ペニシリン Gとストレプトマイシン） を含 む培地が用いられる。
    [0022] 前記のハイプリドーマの培養は、 イン■ ビトロの場合には例 えば培地中で 5 % C 02漶度及び 3 7 eCで約 3日間、 またィン - ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合には約 1 4日間実施 するのが好ましい。
    [0023] 前記のハイプリドーマ P I C— 1、 1〇ー2又は？ 1 0 —3を常法によって培養した培養液から、 あるいは前記 3種の いずれかのハイプリドーマを投与した適当な哺乳動物 （例えば マウス又はラット） の腹水から、 目的とするモノクローナルを 分離し、 精製することが可能である，
    [0024] このようにして製造された培養液又はマウスの腹水からモノ クローナル抗体を分離、 精製する場合にはタンパク質の単離、 精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能である。 そ のような方法としては硫安塩析、 イオン交換クロマトグラフィ 一、 分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、 プ ロティン A結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィ 一、 透析、 凍結乾燥の方法等がある。
    [0025] こうして得られた本発明の抗 P I Cモノクローナル抗体は、 その反応性によって以下の 3種に分類することができる。
    [0026] ( 1 ) P I C及びプラスミノーゲンとは反応するが、 ひ 2—ァ ラスミンィンヒビターとは反応しない第 1のモノクローナル抗 体 （ P I C— 1 〉 β ( 2 ) P I C及び α 2—プラスミンインヒビターとは反応する が、 プラスミノーゲンとは反応しない第 2のモノクローナル抗 体 （ P I C - 2 ) β
    [0027] ( 3 ) P I Cとは反応するが、 プラスミノーゲン及びな 2—プ ラスミンィンヒビターとは反応しない第 3のモノクローナル抗 体 （P I C— 3 ) β
    [0028] 前記の第 1のモノクローナル抗体 （ P I C— 1 ) は、 好まし くはヒトプラスミノーゲンのクリングル 2及びクリングル 3を 含む領域を認識する。
    [0029] 本発明による前記の第 1〜第 3の抗 P I Cモノクローナル抗 体を不溶性担体に固定化させ、 それらの少なくとも 2種を被検 試料と接触させると、 被検試料中の遊離のプラスミノーゲン及 び α 2—プラスミンィンヒビターとは凝集反応を起こさず、 Ρ I cとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、 Ρ I cの免疫学的定置方法に用いることができ、 そして免疫学的 定量用試薬としても有用である。
    [0030] 本発明の免疫学的定量方法に用いる被検試料は、 P I cを含 有する可能性のある試料であれば特に制限されるものではない が、 例えば、 生体試料、 特には血液、 血清、 血漿又は尿、 好ま しく 血漿である。 本発明の免疫学的定量方法においては、 被 検試料を希釈せずに、 そのまま使用しても、 被検試料中に遊離 の状態で存在するプラスミノーゲン及び 2—プラスミンィン ヒビターの妨害を避けることができる。 即ち、 本発明方法によ れば、 被検試料中に存在するプラスミノーゲン及び 2—プラ スミンインヒビターの干渉を受けずに、 ヒトプラスミン一 2 一プラスミンィンヒビター複合体の測定を行うことができる β 不溶性担体としては、 抗原抗体の凝集反応を利用する免疫学 的測定方法において一般的に用いられる任意の不溶性担体を用 いることができ、 例えば、 ラテックス粒子 （特には、 ボリスチ レンラテックス粒子） を挙げることができる，
    [0031] 本発明によるモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させ るには、 公知の方法、 例えば、 化学結合法 （架橋剤としてカル ボジィミド、 ダルタルアルデヒド等を用いる） 又は物理吸着法 を用いることができる。 こうして、 モノクローナル抗体と不溶 性担体との複合体を形成し、 これを本発明の免疫学的定量方法 に用いることができる。
    [0032] 本発明の免疫学的定量方法においては、 前記の不溶性担体に 固定化した少なくとも 2種のモノクローナル抗体を使用するが、 或る 1種のモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化して調製 した複合体を 2種又は 3種用いるか、 あるいは、 2種又は 3種 のモノクローナル抗体を或る 1種の不溶性担体に固定化して調 製した複合体を用いることができる β 更に、 或る 1種のモノク ローナル抗体を不溶性担体に固定化して調製した複合体 1種と、 2種のモノクローナル抗体を或る 1種の不溶性担体に固定化し て調製した複合体 1種との組み合わせを用いることもできる β 本発明のモノクローナル抗体 2種の組み合わせは任意でよいが、 前記の第 1のモノクローナル抗体 （ P I C— 1 ) と第 2のモノ クローナル抗体 （ P I C— 2 ) との組み合わせを用いるのが好 ましい，
    [0033] 本発明の測定方法においては、 前記のモノクローナル抗体固 定化不溶性担体複合体の既知一定量と未知量の P I Cを含有す る水性被検試料の一定量とを適当な反応容器 （例えば、 スライ ド扳上あるいは反応セル） 中で接触させる。 例えば血漿試料の 場合には、 血漿試料（非希釈液） 1容量部に対して前記の複合 体懸濁水（ 1 %以上の瀵度） を 1容量部又は 1容量部以上加え て接触させる。 また、 凝集像をより鮮明にするために、 試料と 複合体懸濁水に更に緩衝液（例えば、 トリス塩酸緩衝液） を加 えて接触させてもよい。 こうして形成される凝集の程度から P I c漶度の定量を行うことができる。 この凝集反応は、 血漿試 料中に存在する遊離のプラスミノーゲン及び α 2 —プラスミン インヒビターの妨害を受けない。 例えば、 スライド板の場合に は目視的に、 反応セルの場合は特定の波長を用いて分光学的に 凝集反応を測定し、 被検試料中の P I C潘度を定量することが できる， 実施例
    [0034] 次に、 本発明を実施例により更に詳細に説明するが、 本発明 は以下の実施例によって限定されるものではない。
    [0035] 実施例 1 ： P I Cの精製
    [0036] ( a ) ヒトプラスミン一 2—プラスミンインヒビター複合体 ( P I C ) の精製は P 1 o wらの方法（丄 Lab.CliiLMed.93,199- 209,1979 )に従って行った。 簡単に説明すると、 ヒト （健常人） 血漿 1 0 O mlをリジンーセファロースカラム （べッド容量、 1 0 0 ml ) に通過させ、 プラスミノーゲンを除去した， プラス ミノーゲン不含のこの血漿に、 プラスミン水溶液（ 6 0〃gZ ml ) 1 0 O mlを徐々に加えた後、 3 7 eCで 1 0分間保温した。 反応後の水溶液をリジン—セファロースカラム （べッド容量、 2 0 O ml ) に通し、 P I Cを吸着させた。 P I C吸着カラムを 0. 1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS) で洗浄した後、 50 mMe—アミノカプロン酸を含む PBSで P I Cを溶出させた， 更に、 得られた P I Cをウルトロゲル AC A44による分子 篩クロマトグラフィーによって精製した， この精製 P I Cを免 疫原及び抗 P I Cモノクローナル抗体のスクリーニングに使用 した。
    [0037] ( b )免疫化脾臓細胞の調製：
    [0038] P I C免疫原溶液（ A280nm=0. 1 ) を等量のフロイン ド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、 その混合液 200 1を BALB/c系マウスの腹腔内に投与することに より免疫を行った （第 1回免疫） ， 30日経過後、 前記と同様 の混合液 200 1を前記マウスの腹腔内に投与した （第 2回 免疫） β 第 2回免疫から 21日経過後、 P I C免疫原溶液（ A 280nm=0. 1 ) を等量の生理食塩水で希釈して調製した P I C希釈液 200 X 1を、 前記マウスの静脈内に投与した （最 終免疫） 最終免疫から 3日経過後、 脾臓を無菌的にマウスか ら取り出し、 次の細胞融合工程に使用した。
    [0039] ( c )細胞融合
    [0040] 15%ゥシ胎児血清を含む DME培地 5mlを入れたシャーレ に、 無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。 次に、 15%ゥシ 胎児血清を含む D M E培地約 15 mlで前記脾臓を還流して脾臓 細胞を流出させた後、 この脾臓細胞懸濁液をナイロンメッシュ に通した。 この脾臓細胞を 5 Oml遠心チューブに集め、 500 で10分間遠心した。 こうして得たペレットにへモライジ ング溶液（ 155m — NH4 C 1、 10mM— KHC03、 1 mM-Na2 EDTA： pH 7. 0 ) 4mlを力！]え、 懸濁させた。 0eCで 5分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。 15% ゥシ胎児血清 1 Omlを含む DM E培地を加えてから遠心分離し た。 こうして得たペレツトを D ME培地で遠心法により洗浄し、 生きている脾臓細胞数を測定した。
    [0041] 一方、 予め培養しておいたマウスミエローマ細胞（骨髄腫細 胞） SP2Z0—Ag l4 (理化学研究所ジーンバンク細胞銀 行）約 2 X 1 07個に前記脾臓細胞 1 X 1 08個を加え、 DME 培地中でよく混合し、 遠心分離を行った （ 500 Xg、 1 0分 間） 。 その上清を吸引し、 ペレットをよく解きほぐし、 40% ボリエチレングリコール 4000溶液（38eCに保温） 0. 5 mlを滴下し、 遠心チューブを手で 1分間穏やかに回転すること によってボリエチレングリコール溶液と細胞べレットとを混合 させた， 次に、 38eCに保温しておいた DME培地を 30秒毎 に lmlずつ加えて、 チューブを穏やかに'回転させた。 この操作 を 10回繰り返した後、 15%ゥシ胎児血清 2 Omlを含む DM E培地を加えて、 遠心分離（ 5 OOXg、 10分間） を行った。 上清を除去した後、 15%ゥシ胎児血清を含む HAT培地（D ME培地にアミノプテリン 4X 10一7 M、 チミジン 1. 6X 10一5 M、 ヒボキサンチン 1 X 10一4 Mになるように添加した もの）'で細胞ペレットを遠心法によって 2回洗浄した後、 前記 HAT培地 4 Omlに懸濁した。 この細胞懸濁液を 96ゥエル細 胞培養プレートの各ゥエルに 2 O OJL 1ずつ分注し、 5%炭酸 ガスを含む炭酸ガス培養器で 37 eCにて培養を開始した。 培養 中、 2〜3日間隔で各ゥエルの培地を約 100 1除き、 新た に前記の HAT培地 100 1を加えることにより HAT培地 中で増殖するハイプリドーマを選択した。 8日目から 15%ゥ シ胎児血清を含む HAT培地（DME培地にチミジン 1. 6 X 10一5 M、 ヒポキサンチン 1 X 10一4 Mになるように添加した もの） に交換し、 ハイプリドーマを観察するとともに、 10日 目に、 後記の EL I S A法により、 P I C抗体産生ハイプリド 一マをスクリーニングした。
    [0042] ( d )ハイプリドーマの樹立
    [0043] ハイプリドーマ培養液の上清における産生抗体の有無は EL I SA法により測定した， 96ゥエル EL I SA用プレート ( Immulonll 日本ダイナテック株式会社） の各ゥエルに前記 の P I C免疫原溶液（ A28 Onm=0. 05、 生理食塩水で希 釈した） 5 ずつを分注し、 25eCで 2時間放置した。 次 に、 0. 05%Twe e n20—生理食塩水で 3回洗浄した後、 各ゥエルに培養液上清 50 1を加え、 25 'Cで 1時間反応さ せた。
    [0044] 次に、 Twe e η 20—生理食塩水で 200倍に希釈したぺ ルォキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、 デンマーク） 50 1を各ゥエルに加えた。 反応終了後、 0. 05%Twe e n 20—生理食塩水で各ゥエルを 3回洗浄し、 0. 5m ァミノ アンチビリン、 1 OmMフエノール及び 0. 005%過酸化水 素水を含む溶液 250u Iを各ゥエルに加え、 25eCで 30分 間反応させ、 各ゥエルの 49 Onmにおける吸光度を測定した。 その結果、 192ゥエル中、 3ゥエルに抗体産生が認められた。 その 3ゥエル中のハイプリドーマを 24ゥエルプレートに移し、 15 %ゥシ胎児血清を含む H A T培地で 4〜 5日間培養した。 その後、 再度 EL I S A法によって抗 P I C抗体の産生の有無 を確認してから限界希釈法によりクローニングした。 限界希釈 法は、 H T培地でハイプリドーマが 5個 Zmiとなるように希釈 した細胞浮遊液を、 予め正常 B A L B Z C系マウスの腹腔細胞 がゥエル当たり 2 X 1 0 4個分注してある 9 6ゥエルプレート の各ゥエルに 1 0 0〃 1ずつ分注した。 1 0日後、 E L I S A 法によって抗 P I C特異的抗体を産生するハイプリドーマのク ローンをスクリーニングした。
    [0045] その結果、 各ノ、イブリドーマにつき、 2 0〜4 0個の抗体産 生クローンが得られた。 これらのクローンの中から、 増殖力が 強く、 抗体分泌能が高く、 しかも安定なクローンを選び、 前記 と同様の方法で再クローン化を行い、 3種の抗 P I C抗体産生 ハイブリドーマ P I C— 1、 P I C— 2及び P I C— 3を樹立 した。 これら 3種のハイプリドーマから分泌される 3種のモノ クローナル抗体 P I C— 1、 P I C— 2及び P I C— 3とヒト プラスミノーゲン （ァテンズ ' リサーチ社、 アメリカ） あるい はヒト 2—プラスミンインヒビター （ァテンズ ' リサーチ社、 アメリカ） との反応性を、 9 6ゥエル E L I S A用プレートに ヒトプラスミノーゲンあるいはヒト《 2—プラスミンインヒビ ターを被覆し、 前記の E L I S A法と同様の方法により調べた。 モノ ローナル抗体 P I C— 1はヒトプラスミノーゲンと反応 したが、 ヒト α 2—プラスミンィンヒビターとは反応しなかつ た。 モノクローナル抗体 P I C— 2は α 2—プラスミンインヒ ビターと反応したが、 ヒトプラスミノーゲンとは反応しなかつ た。 一方、 モノクローナル抗体 P I C— 3はヒトプラスミノー ゲンにも、 ヒト α 2—プラスミンィンヒビターにも反応しなか つた。
    [0046] 前記の各ハイプリドーマは通商産業省工業技術院微生物工業 技術研究所 （あて名：〒 305日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に 1990年 12月 4日から国内寄託され、 199 1年 12月 1 6日から国際寄託に移管されている。 国際寄託番 号 （1 際寄託番号につづく [] 内は国内寄託番号〉 は、 ハイブ リドーマ P I C一 1が微ェ研条寄第 3681号（ FERM B P - 3681 ) [微ェ研菌寄第 1 1888号 （FERM P 一 1 1888 ) ] 、 ハイプリドーマ P I C一 2が微ェ研条寄 第 3682号 （FERM BP— 3682 ) [微ェ研菌寄第 1 1889号 （ FERM P— 1 1889 ) ] そしてハイブリド 一マ P I C— 3が微ェ研条寄第 3683号 （ FE RM BP - 3683 ) [微ェ研菌寄第 1 1890号（ FERM P— 1 1890 ) ] である。
    [0047] 実施例 2 ： モノクローナル抗体の製造
    [0048] ( a ) イン ' ビト口法
    [0049] マウスハイプリドーマ P I C— 1、 ？ 10— 2及び 10 一 3を、 それぞれ 1 5%ゥシ胎児血清を含む DME培地で、 37でで 5%二酸化炭素雰囲気中において 72〜96時間培養 した。 培養物を遠心分離 （ 1000 OX g、 10分間） 後、 上 清に固形の硫酸アンモニゥムを 50%最終濃度となるように徐 々に加えた。 混合物を氷冷下で 30分間撹拌した後、 60分間 放置してから遠心分離 （ 10000 Xg、 10分間）処理し、 得られた沈渣を少量の 1 OmMリン酸緩衝液 （pH8. 0 ) に溶 解し、 1000倍量の 1 OmMリン酸緩衝液ですでに平衡化し た DEAE—セルロースのカラムに充填した。 モノクローナル 抗体の溶出は 1 OmMリン酸緩衝液（pH8. 0 ) と 0. 2M -NaC 1 を含む 1 OmMリン酸緩衝液 （pH8. 0 ) の間で濃 度勾配法により行った。 溶出されたモノクローナル抗体を限外 沪過法で镌縮し、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH8. 0 ) に対して 透析した。 ゥシ血清 I gGを除くために、 透析物をャギ抗ゥシ 血清 I gG—セファロース 4 Bカラムに通した。 次に、 通過液 を 0. 1Mリン酸緩衝液（pH8. 0 ) で平街化したプロテイン A—セファロース 4Bカラムに充填した β カラムを pH3. 5の 緩衝液で溶出して、 精製した抗 P I C特異モノクローナル抗体 P I C— 1、 同様にモノクローナル抗体 P I C— 2、 及びモノ クローナル抗体 P I C— 3の溶液を得た。
    [0050] ( b ) イン · ビボ法
    [0051] プリスタン （2, 6, 10， 14—テトラメチルペンタデカ ン） 0. 5mlを 10〜12週齢の B ALB/c系マウスの腹腔 内に投与し、 それから 14〜20日目のマウスの腹腔内にィン ビトロで増殖されたハイプリドーマ P I C— 1、 P I C— 2、 又は P I C— 3をマウス一匹あたり 2X 106個となるように 接種した。 各ハイプリドーマにつき一匹のマウスから約 10 〜15 mlの腹水が得られた。その抗体瀵度は、 2〜1 OmgZ mlであった。 腹水中のモノクローナル抗体の精製は、 前記のィ ン -ビトロ精製と同様の方法（但し、 ャギ抗ゥシ血清 I gG —セファロース 4 Bのカラムを通す操作を除く） で行なった。 実施例 3 ：モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及び特 異性の同定
    [0052] 抗 P I C特異モノクローナル抗体 P I C— 1、 P I C— 2及 び P I C— 3の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定はそれ ぞれォクテロニー免疫拡散法、 ェンザィムィムノアツセィ法及 びィムノブロッ卜法により行った。 結果は表 1に示す通りであ る。
    [0053] 表 1
    [0054] モノクロ- 免疫ク"ロフ" ヒトズラスミノーゲ'ン PICとの ヒト α 2-ズラスミンイン ナル抗体 リンクラス との^ ε 反応性 ヒビタ—との
    [0055] PIC-1 IgG,有無 + +
    [0056] PIC-2 IgG, + +
    [0057] PIC-3 IgG, +
    [0058] 表 1 (続き〉
    [0059] モノクロ一 ヒトフ°ラスミノーケ"ンクリンク" ヒトフ°ラスミノーケ"ンクリン ヒト val-グラスミノ一ケ" ナル抗体 ル 2及び 3を含む クル 1との反応性 ンとの反応性
    [0060] 領域との反応性
    [0061] PIC-1
    [0062] PIC-2 4ΠΡ
    [0063] PIC-3
    [0064] 表 1において、 「十」 は EL I S Α法で反応を示すこと無無無を、 そ して 「一」 は EL I S A法で反応を示さないことを意味する。 更に、 「有」 はィムノブロット法で反応を示すことを、 そして 「無」 はィムノブロット法で反応を示さないことを意味する。 実施例 4 ：抗体と不溶性担体 （ラテックス） との結合
    [0065] モノクローナル抗体 P I C— 1 ( 2. 0 mg/ml ) を含有す る水溶液 2mlと、 ラテックス溶液 （ 2%、 Dow Chemical社： 粒 径 0. 482 m) 2mlとを混合し、 約 1時間撹拌した。 遠心 ( 20 , 000 X g、 1 0分間） した後、 沈澱を 0. 1 %B S A溶液に懸濁し、 約 1時間撹拌した。 再び遠心 （ 20, 000 X g、 10分間） した後、 沈澱を水に懸濁し、 約 2時間撹拌し た。 こうして、 モノクローナル抗体 P I C一 1 Zラテックス複 合体含有液を得た。 同様にしてモノクローナル抗体 P I C - 2 又はモノクローナル抗体 P I C— 3を用いて、 単独の各モノク ローナル抗体とラテックスとの複合体の含有液を調製した。 抗体混合物とラテックスとの複合体は以下のように調製した。 モノクローナル抗体 P I C— 1、 モノクローナル抗体 P I C 一 2及びモノクローナル抗体 P I C— 3をそれぞれ 0 . 6 6mg /mlずつ含有する水溶液 2 mlと、 ラテックス溶液 （ 2 %、 Dow Chemical社：粒径 0 . 4 8 2 u m ) 2 mlとを混合し、 約 1時間 撹拌した。 以下、 前記と同様に処理して、 モノクローナル抗体 P I C— 1 Zモノクローナル抗体 P I C一 2 Zモノクローナル 抗体 P I C— 3 ラテックス複合体を調製した。
    [0066] モノクローナル抗体 P I C一 1及びモノクローナル抗体 P I C— 2をそれぞれ 1 mg/mlずつ含有する水溶液とラテックス 溶液とを等 i混合すること以外は前記と同様にして、 モノクロ ーナル抗体 P I C一 1 Zモノクローナル抗体 P I C— 2 ラテ ックス複合体を調製した。
    [0067] 実施例 5 スライ ド凝集反応による定量
    [0068] 実施例 4で調製した抗体ラテックス複合体含有液 4 0 1 と 種々な漶度の P I Cを含有する水溶液 4 0 1 とをスライ ドガ ラス上で混合し、 揺動して 3分後に凝集像を目視的に判定した。 結果を以下の表 2に示す。
    [0069] 表 2において、 「 +」 は凝集ありを、 そして 「一」 は凝集な しを各々意味する。 また、 表 2の抗体 ラテックス複合体の欄 において、 複合体の種類をその複合体に結合するモノクローナ ル抗体によって示す。 徒って、 例えば P I C - 1はモノクロ一 ナル抗体 P I c— 1/ラテックス複合体を意味し、 P I C— 1 十 P I C一 2はモノクローナル抗体 P I C— 1 ラテックス複 合体とモノクローナル抗体 P I C— 2ノラテックス複合体との 等量混合液を意味する。 更に、 P I C— 1ZP I C— 2はモノ クローナル抗体 P I C一 1 モノクローナル抗体 P I C-2/ ラテックス複合体を意味する。
    [0070] 表 2
    [0071] モノクローナル抗体 PIC潘度 （ ug ml)
    [0072] ラテックス複合体 256 128 64 32 16 8 の種類 -512 -256 -128 -64 -32 -16
    [0073] PIC-1 一 一 一 一 一 一
    [0074] PIC-2 一 — 一 一 一 —
    [0075] PIC-3 — 一 — 一 一 一
    [0076] PIC-1十 PIC-2 + + + 十 + +
    [0077] PIC-1/PIC-2 十 + + 十 + +
    [0078] PIC-1+PIC-2
    [0079] + PIC-3 十 + + 十 + +
    [0080] PIC-1/PIC-2
    [0081] /PIC-3 + + + + + + 表 2 (続き）
    [0082] モノクロ-ナル抗体 PIC漶度 （ x sZml)
    [0083] Zラテックス複合体 4 2 1 1 0.5
    [0084] の種類 -8 -4 -2 -0.5 -0.25
    [0085] PIC— 1 一 一 一 一 一
    [0086] PIC-2 — 一 一 一 -
    [0087] PIC-3 — 一 一 一 一 PIC-l + PIC-2 十 + 十 十
    [0088] PIC-l/PIC-2 + 十 + +
    [0089] PIC-l+PIC-2
    [0090] +PIC-3 + + + +
    [0091] PIC-l/PIC-2
    [0092] /PIC-3 + + + +
    [0093] 表 2において、 「 +」 は凝集ありを、 そして 一」 は凝集なし を各々意味する。 実施例 6 ：精製 P I Cの添加回収試験
    [0094] 5種の検体（健常人 A、 健常人 B、 D I C患者 C、 D I C患 者 D及び D I C患者 Eから採取した血漿） 中の P I C濃度を、 実施例 5のモノクローナル抗体 P I C— 1ノモノクローナル抗 体 P I C一 2Zラテックス複合体溶液を用いて測定した。 次い で、 それぞれの検体に精製 P I C 2/i gZml、 4 gZml及び
    [0095] 8 gZmlを添加し、 添加回収試験を行った。 測定値は検体を 倍々希釈して凝集の消失する希釈倍数から半定量的に測定した。 結果は表 3に示すように、 良好な回収が得られた。
    [0096] 表 3
    [0097] 検体 PIC測定量 PIC添加量 添加後の測定値
    [0098]
    [0099] A < 2 2-4
    [0100] 4 4-8
    [0101] 8 8-16
    [0102] B < 2 2-4
    [0103] 4 4-8 8 8- 16
    [0104] C -2 2 2-4
    [0105] 4 4-8
    [0106] 8 8- 16
    [0107] D 4-8 2 4-8
    [0108] 4 8- 16
    [0109] 8 8- 16
    [0110] E 8- 16 2 8— 16
    [0111] 4 8- 16
    [0112] 8 16-32 実施例 7 ：健常人と D I C患者群の P I C値
    [0113] 実施例 6で使用したモノクローナル抗体 P I C— 1 //モノク ローナル抗体 P I C一 2/ラテックス複合体溶液を用いて、 健 常人血漿 12検体、 D I C患者血漿 15検体の P I C量を測定 した， 結果を図 1に示す。 健常人群の P I C量は全例
    [0114] ml未満であった， それに対して D I C患者群は全例 2AdgZml 以上であった。 産業上の利用可能性
    [0115] 以上詳細に説明したとおり、 本発明によれば、 血漿試料の希 釈操作を行わなくても、 血漿中の遊離プラスミノーゲン及び遊 離ひ 2 —プラスミンィンヒビターの干渉を受けることなく、 患 者血漿中の P I C量を特異的に、 簡便かつ迅速に、 凝集法によ り測定することができる。 これは、 本発明によって初めて可能 になったものである。 従って、 本発明は D I C等の診断及び病 理研究に有用な手段を提供するものである
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . ヒトプラスミン一 α 2—プラスミンインヒビター複合体及 びヒトプラスミノーゲンと特異的に反応するモノクローナル抗 体。
    2 . ヒトプラスミノーゲンのクリングル 2及びクリングル 3を 含む領域を認識する請求項 1記載のモノクローナル抗体。
    3 . ヒトプラスミン一 な 2—プラスミンィンヒビター複合体で 免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との 融合によって形成され、 ヒトプラスミン一 α 2—プラスミンィ ンヒビタ一複合体及びヒトプラスミノーゲンと特異的に反応す るモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ又はそれに由 来する細胞株。
    4 . 前記のモノクローナル抗体がヒトプラスミノーゲンのクリ ングル 2及びクリングル 3を含む領域を認識する、 請求項 3記 載のハイプリドーマ又はそれに由来する細胞株。
    5 . ヒトプラスミン一 α 2—アラスミンインヒビター複合体お ょヒト α 2—プラスミンィンヒビターと特異的に反応するモノ クローナル抗体 β
    6 . ヒトプラスミン一な 2—プラスミンィンヒビター複合体で 免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との 融合によって形成され、 ヒトプラスミン一 α 2—プラスミンィ ンヒビター複合体及びヒト ひ 2—プラスミンインヒビターと特 異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハイプリ ドーマ 又はそれに由来する細胞株。
    7 . ヒトプラスミン一ひ ープラスミンインヒビター複合体と 特異的に反応し、 ヒトプラスミノーゲン及びヒ トな 2 —プラス ミンィンヒビターとは反応しないモノクローナル抗体，
    8 . ヒトプラスミン一な 2—プラスミンィンヒビター複合体で 免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との 融合によって形成され、 ヒトプラスミン一 α 2—プラスミンィ ンヒビター複合体と特異的に反応し、 ヒトプラスミノーゲン及 びヒト α 2 —プラスミンィンヒビターとは反応しないモノクロ ーナル抗体を分泌するハイプリドーマ又はそれに由来する細胞
    9 . 不溶性担体に固定化された、 請求項 1、 請求項 5及び請求 項 7記載のモノクローナル抗体少なくとも 2種と、 被検試料と を接触させ、 被検試料における凝集反応を観察することを特徴 とする、 ヒトプラスミン一な 2—プラスミンインヒビター複合 体の測定方法。
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